逍遥学能 2014-01-17 09:47
摘 要 基因工程是高中生物教学的重点和难点，理解重组质粒的相关知识是突破难点的关键所在。本文以高考试题评析的形式，辨析重组质粒的疑难问题，旨在为以后的高三复习备考提供参考。
关键词 重组质粒 辨析 限制性核酸内切酶 目的基因
例题（2011年高考理综浙江卷第6题）将ada（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是
A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒
B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada
D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子
参考答案：C
考生对A选项基本没有异议，因为题干中说明了ada已在大肠杆菌细胞内成功表达，说明大肠杆菌细胞内必定含有携带ada的重组质粒，故A选项表述的含义正确。B、C、D三个选项在师生中引起广泛争议，甚至有人认为试题存在科学性错误。下面是一些具有代表性的错误观点和笔者对相关疑难问题的阐述。
1 重组质粒是否含有限制性核酸内切酶识别位点
认为B选项表述的含义是错误的原因分析：目的基因和质粒能够形成重组质粒的关键是目的基因和质粒被限制性核酸内切酶切割后具有相同的粘性末端。形成相同的粘性末端可以采用两种方法：①用相同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒；②用同尾酶切割目的基因和质粒。若选择同尾酶分别切割目的基因和质粒，再由DNA连接酶作用形成重组质粒。该重组质粒可能无法被同尾酶中的任何一种限制性核酸内切酶识别和切割。如限制酶BglⅡ的识别序列为A↓GATCT（↓表示切割位点，下同），限制酶BamHⅠ的识别序列为 G↓GATCC。若用BglⅡ切割目的基因（见图1），用BamHⅠ切割质粒（见图2），可获得具有相同粘性末端序列（GATC）的DNA片段。再用DNA连接酶处理形成重组质粒（见图3），其“接点”的碱基序列为5’ AGATCC 3’，既不能被BglⅡ识别，也不能被BamHⅠ识别，故认为重组质粒可能不存在限制性核酸内切酶的识别位点。
实际上基因工程技术的操作过程中会遇到很多问题，如重组质粒导入受体细胞后，目的基因的表达可能会出现目的基因不表达、表达水平过低或过高、表达产物的氨基酸序列差错等多种表达异常情况。当出现目的基因的表达异常时，需要回收目的基因，并对目的基因进行加工修饰，最终使目的基因表达出人们所预期的效果。因此在构建重组质粒时，要求连接形成的“接点”序列，必须能被特定的限制性核酸内切酶识别、切割，以便回收插入质粒的目的基因。以图3所示的重组质粒为例，它还可以被识别序列为↓GATC的限制性核酸内切酶切割回收。如使用MboⅠ或Sau3A（两者的识别序列都为↓GATC）处理该重组质粒时，在两个“接点”位置将重组质粒重新切割开，形成两个片段，即目的基因和质粒（见图4）。
因此B选项表述的“每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点”是正确的。当然准确地说应该至少含有两个限制性核酸内切酶识别位点。
2 质粒的每个限制性核酸内切酶识别位点是否都要插入目的基因
认为C选项表述的含义是正确的原因分析：具有一种或多种限制性核酸内切酶的单一切割位点是理想质粒载体的基本条件之一，同时该切割位点就是目的基因的插入位点。也就是说如果用某一特定的限制性核酸内切酶（如BamHⅠ）作用于基因工程质粒载体（如pET28b）只会产生一个切口，故认为该切口插入一个目的基因（如ada）是目的基因成功表达（如合成腺苷酸脱氨酶）的前提条件。
基因工程通常不选择天然质粒直接作为目的基因的载体，而选择以天然质粒为基础，人工改造和组建形成的实用质粒作为目的基因的载体。这种实用质粒不是单纯为某一目的基因构建的，而需要有较广泛的使用功能，也就是说要能够和多种目的基因形成重组质粒。由于不同的目的基因两端的碱基序列存在差异，因此提取不同的目的基因选择的限制性核酸内切酶也不同，所以这种实用质粒就需要有多种限制性核酸内切酶的单一切割位点。如质粒pET28b具有BamHⅠ、BglⅡ、HindⅢ等16种限制性核酸内切酶的单一切割位点，若用BamHⅠ处理质粒pET28b，在其产生的切口中插入ada形成重组质粒，该重组质粒的另外15个限制性核酸内切酶识别位点都没有插入ada。故C选项的含义错误。
3 每个插入的目的基因是否都要表达
认为D选项表述的含义是错误的原因分析：重组质粒随机导入大肠杆菌细胞内，可能存在多个重组质粒同时导入同一个大肠杆菌细胞内的情况。此时只要其中一个重组质粒上的ada表达，其它重组质粒上的ada不表达，该大肠杆菌也能够合成腺苷酸脱氨酶。故认为插入质粒的ada不一定都表达了腺苷酸脱氨酶分子。
基因工程技术操作过程，需要对转化条件的控制，使每个受体细胞只进入一个重组DNA分子[1]。也就是说试题中提到的大肠杆菌细胞内只含有一个重组质粒，因此只要该大肠杆菌有腺苷酸脱氨酶的产生，就说明插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子。故D选项的含义正确。
综上所述，该试题本身并没有科学性的错误。导致考生困惑的主要原因是教师在教学过程中仅仅停留在基因工程的基本原理和理想化的简要步骤的层面上，没有抓住重组质粒的形成、特点和表达等核心问题，阐述基因工程的相关知识。
对今后教学的启示：基因工程的教学应选择学生感兴趣的实例（如胰岛素、乙肝疫苗的生产等），将具体的研究过程和生产工艺作为学生课外预习材料，课堂上引导学生归纳原理和基本生产步骤。再以重组质粒为核心概念对相关疑难点进行探讨。这种以科学实例为基础的合作探究式教学不仅可以帮助学生构建知识网络，突破难点，而且能够有效激发学生的学习兴趣，培养学生搜集信息和自主学习的能力，也是符合新课程理念的有效教学方法。