逍遥学能 2017-01-13 17:41
蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤
一、注意事项：
1. 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。
2. 盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。
3. 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。
4. 盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。3.5为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。
5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50 处理。
6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。
二、实验步骤：
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大(20度时饱和溶液为754克/升;0度时饱和溶解度为706克/升)，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
表1 几种盐在不同温度下的溶解度(克/100毫升水)
0℃
20℃
80℃
100 ℃
(NH4)2SO4
70.6
75.4
95.3
103
Na2SO4
4.9
18.9
43.3
42.2
NaH2PO4
1.6
7.8
93.8
101
饱和硫酸铵法：
1. 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
2. 4℃，3h以上，使其充分沉淀离心(3000rpm),20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
3. 置4℃3h以上，[此时，(NH4)2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
4. 对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内(常用的是玻璃纸)，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。